Soutenance de thèse de Anouchka Gatin – mardi 19 juillet à 9h30

10 July 2022 par clavaguera
Anouchka Gatin du groupe CPSysBio soutiendra sa thèse le mardi 19 juillet à 9h30

Anouchka a effectué sa thèse sous la direction de Cécile SICARD-ROSELLI:

"Dimérisation oxydative de protéines via des pontages d'acides aminés aromatiques"

La soutenance aura lieu en salle Magat.

Résumé de la thèse en français :

La formation de pontages protéiques covalents impliquant des acides aminés aromatiques (tyrosine, tryptophane) a été associée à de nombreux processus biologiques aussi bien physiologiques que pathologiques. La bi-tyrosine, utilisée comme biomarqueur de l’oxydation protéique en est l’exemple type: elle a été mise en évidence dans des nombreuses protéines isolées, tissus et fluides biologiques. Dans le cadre de cette thèse, l’étude de la dimérisation covalente via des acides aminés aromatiques sera abordée à travers l’oxydation i) de protéines isolées, de peptides et d’acides aminés libres en solution, ii) d’un complexe protéique formé de la centrine 2 humaine (CEN2) et de la protéine Xeroderma Pigmentosum (XPC) puis iii) de cellules humaines de cancer du sein.
La formation de radicaux oxydants, comme le radical hydroxyle (•OH) et le radical azoture (N3•) sera médiée par l’irradiation des échantillons protéiques en solution aqueuse sous rayonnement gamma. La formation des pontages covalents induits sous oxydation radiolytique sera principalement analysée par chromatographie liquide ultra performance couplée à la spectrométrie de masse (UPLC-MS). Une nouvelle méthodologie analytique basée sur le marquage isotopique et les échanges H/D a été développée pour déterminer la nature des liaisons chimiques en étant à l’origine.
Dans un premier temps, l’étude de la dimérisation de la tyrosine à l’échelle de l’acide aminé isolé a permis de mettre en évidence la formation d’au moins quatre isomères de bi-tyrosine. La démarche d’analyse mise en place a permis d’identifier une nouvelle famille de dimères de tyrosine. Ces derniers résultent de réactions de cycloaddition de Michael intramoléculaires et impliquent la position para du radical tyrosyle à l’origine de la dimérisation.
Dans un second temps, la pluralité structurale des dimères a été confirmée à l’échelle protéique. La coexistence de nombreux intermédiaires et produits finaux d’additions de Michael a été soulignée, notamment via des expériences de spectrométrie de mobilité ionique (IMS). Tandis que la protéine considérée possède aussi des résidus tryptophane, des pontages tyrosine-tyrosine, tyrosine-tryptophane et tryptophane-tryptophane ont été détectés.
En troisième lieu, le comportement oxydatif de dimérisation de complexes protéiques formés de la CEN2 et de deux fragments de taille différente de la XPC a par la suite été étudié. Il a permis de mettre en évidence pour la première fois la formation de pontages covalents interprotéiques entre les deux partenaires. En fonction de la séquence en acides aminés du fragment considéré de la XPC (présence ou non d’un résidu tyrosine), la nature des liens covalents diffère : tyrosine-tyrosine ou tyrosine-tryptophane. Toutefois, quelle que soit la nature des pontages formés, les deux partenaires protéiques se lient de manière covalente lors d’une attaque oxydative. Dans le cadre de la formation de pluriels pontages tyrosine-tryptophane, une analyse détaillée de la nature des liaisons chimiques en étant à l’origine a été menée à l’échelle des acides aminés isolés et a amené à proposer de nouveaux types de pontage.
Enfin, une approche in-cellulo de détection de pontages covalents de la CEN2 formés lors de l’exposition à des radicaux oxydants a été entreprise. Les conditions de détection de la CEN2 endogène et de ses potentiels dimères ont été mises au point par Western-Blot. L’enrichissement en CEN2 des extraits cellulaires par immunoprécipitation et précipitation au sulfate d’ammonium a également été réalisé. Ces expériences préliminaires ouvrent la voie à l’investigation future de pontages covalents formés in-cellulo.