Etude de l'assemblage et de l'activation de la NADPH oxydase de phagocyte au niveau des membranes cellulaires

Cette thèse a été en cotutelle entre l'université Paris-Saclay et l'université Libanaise dirigée par Tania Bizouarn (ICP)  et co-encadrée par Sophie Dupré-Crochet (ICP).

La soutenance aura lieu le jeudi 8 décembre 2022 à 14h dans la salle Magat. La soutenance aura lieu en français.

Résumé de la thèse en français :

Les neutrophiles, cellules phagocytaires, détruisent les pathogènes envahissant le corps humain grâce à une production massive d’espèces réactives de l’oxygène (ERO ou FRO) dans un compartiment intracellulaire : le phagosome. Le précurseur de ces ERO, l’anion superoxyde est produit par la NADPH oxydase un complexe protéique formé à la membrane phagosomale. L’enzyme peut également être localisée dans la membrane plasmique et produit alors des ERO dans l’espace extracellulaire. Une surproduction d’ERO peut alors être responsable d’inflammations pathologiques alors que l’absence de NADPH oxydase est à l’origine d’une maladie grave, la granulomatose septique chronique (CGD) où les patients développent des infections récurrentes car ils sont incapables de détruire les pathogènes. Certains pathogènes peuvent aussi échapper à cette destruction en modifiant la membrane des phagosomes. La NADPH oxydase est finement régulée dans l’espace et le temps. Elle est constituée de six sous-unités : deux protéines membranaires (Nox2 et p22phox) constituant le centre catalytique et quatre protéines cytosoliques (p67phox, p47phox, p40phox et Rac). L’activation de Nox2 est basée sur l’assemblage des protéines cytosoliques avec les protéines membranaires. Cet assemblage se fait d’une part par des interactions entre les protéines et d’autre part, par des interactions avec les phospholipides. Le but de ma thèse a été d’étudier les interactions protéine-lipide qui se mettent en jeu afin d’activer Nox2. Une protéine de fusion chimérique appelée "Trimère " a été l’outil principal dans ce travail. Il est composé des domaines de p67phox, p47phox et Rac1 indispensable à l’activation de l’enzyme. Trois variants du trimère prototype ont été utilisés, les trimères mutants p47 ∆PX, Rac1 PB2 et Rac1 PB6Q. Les mutations ont été créés afin d’étudier l’implication des deux domaines d’interactions avec les lipides, PX de p47phox et PB de Rac1 dans l’activation de Nox2. Suite à des mesures in vitrode production d’anion superoxyde par la NADPH oxydase et la détermination de l’affinité des trimères vis-à-vis des protéines membranaires de neutrophiles, complété par des mesures d’activité in cellulo, nous avons montré un rôle important du domaine PB de Rac1 pour la formation du complexe mais aussi pour son activité alors que le domaine PX est surtout important pour son assemblage in vitro. Dans la deuxième partie de ma thèse, l’étude s’est portée sur la fixation du trimère aux membranes en utilisant un système biomimétique : des liposomes de différentes compositions en phospholipides ainsi que la lignée de cellules myéloïde (PLB-985) différenciable en cellules phagocytaires. Les interactions entre les trimères et les membranes ont été détectés par microscopie confocale de fluorescence mais aussi par la technique de bio-layer-interférométrie.  Ces expériences ont montré que le prototype se fixe très efficacement sur des liposomes contenant des phospholipides anioniques ainsi que sur la membrane plasmique et phagosomale de ces cellules phagocytaires. Le domaine PX s’est révélé très important pour la fixation du trimère sur ces liposomes alors que le domaine PB s’est montré de nouveau nécessaire pour une bonne fixation aux membranes plasmique et phagosomale des cellules PLB-985. Pour conclure, ces études ont montré un rôle important des interactions protéines-lipides pour le maintien du complexe mais aussi une régulation fine de la formation du complexe en fonction de la composition en phospholipides, qui demande à être mieux définie. Cette connaissance pourrait être utile pour contrôler la production d’anion superoxyde par la NADPH oxydase de phagocyte.