La détermination de paramètres physico-chimiques en cellule vivante requiert des méthodes adaptées à la complexité et aux contraintes des milieux biologiques. Nous travaillons à la mise au point de techniques d’imagerie robustes, quantitatives et multimodales, qui s’appuient sur une parfaite connaissance des processus photophysiques sous-jacents et le développement d’instruments dédiés, comme le microscope FLIM BI-FLUOR sur le plateau technique SpICy.

En particulier, le FRET entre deux protéines fluorescentes fusionnées à des protéines d’intérêt permet de visualiser leur interaction et d’accéder à la topologie ou la stœchiométrie de cette dernière dans l’environnement cellulaire. Nous détectons le FRET via la mesure de la durée de vie de fluorescence du partenaire donneur, en mode image (FLIM). Cette stratégie, qui permet une analyse quantitative du FRET, est en plein renouveau notamment grâce à de nouvelles méthodes d’analyse des images.

Nous avons développé une stratégie qui combine FRET-FLIM et FCCS pour étudier la NADPH oxydase des phagocytes. C’est une enzyme qui produit des anions superoxydes, un précurseur des espèces réactives de l'oxygène (ROS) essentielles aux réponses de l'hôte aux infections microbiennes. Elle est constituée de deux sous-unités membranaires (NOX2 et p22) et de trois sous-unités cytosoliques (p40, p47 et p67). Nous avons caractérisé les interactions inter- et intramoléculaires des sous-unités cytosoliques et élucidé leur conformation, leur stœchiométrie, leur fraction d'interaction et leurs affinités en cellules vivantes. De plus, en combinant les données FRET avec des modèles de diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) et des structures cristallines publiées de domaines et sous-unités isolés, nous avons construit un modèle 3D de l'ensemble du complexe cytosolique [Ziegler2019, Valenta2022].

Nous développons de nouveaux projets pour détecter les sites de contacts entre membranes (post doc M. Abdesselem, thèse D. Zamiati, ANR ApicolipidTraffic 2023-2027).