Ingénierie de nouvelles protéines fluorescentes

Dans cet axe, nous étudions comment la structure et la dynamique des protéines fluorescentes conditionnent leurs propriétés essentielles pour l’imagerie : brillance, photochromisme, photoblanchiment, stabilité en température et pH, équilibres d’association, réactions d’oxydation. Cette étape est essentielle pour proposer des variants améliorés et adaptés aux applications en imagerie. Nous nous intéressons principalement aux variants cyans et jaunes de la EGFP qui sont les partenaires les plus populaires pour les expériences de FRET.

Dans ces études, nous combinons la mutagenèse dirigée, la spectroscopie UV-visible (absorption et fluorescence stationnaire et résolue en temps, dichroïsme circulaire), les analyses biochimiques et structurales (spectrométrie de masse, cristallographie, ultracentrifugation analytique, stopped-flow) et des approches de modélisation et de dynamique moléculaire (en collaboration avec l’équipe ThéoSim de l’ICP).

Nous avons récemment démontré que la protéine fluorescente jaune dimérique, tdLanYFP [Bousmah2021], dérivée d’une protéine tétramérique découverte chez le lancelet Branchiostoma lanceolatum présente des propriétés exceptionnelles. Elle se distingue par un rendement quantique de 0,92 et un coefficient d'extinction de 133000 mol-1.L.cm-1, un pK1/2 de 3,9 - très faible comparé aux autres YFPs – ainsi qu’une photostabilité environ 10 fois supérieure à celle des YFPs tant in vitro qu’in cellulo.

Grâce à ces performances remarquables sous irradiation, la tdLanYFP est compatible non seulement avec la nanoscopie STED (stimulated-emission-depletion ou déplétion par émission stimulée), mais aussi avec l'utilisation de spectromicroscopies en régime de molécule unique comme la FCS (fluorescent correlation spectroscopy ou spectroscopie de corrélation de fluorescence). Ainsi, la tdLanYFP enrichit la panoplie des protéines fluorescentes adaptées aux techniques de microscopie nécessitant des régimes d’irradiation intenses, un domaine dans lequel les YFPs étaient jusqu'à présent peu représentées en raison de leur faible photostabilité. De plus, la tdLanYFP s’avère être un partenaire FRET efficace, que ce soit en tant que donneur ou accepteur. Ses performances ont été démontrées notamment dans un biosenseur d’activité kinase AURKA. [Bertolin2019].

Les YFPs perdent progressivement leur fluorescence quand le pH diminue ce qui limite leur utilité dans des compartiments cellulaires acides. Nous avons montré que cette sensibilité au pH est limitée quand les YFPs interagissent avec des protéines synthétiques, les alphaRep à la fois in vitro et dans des cellules vivantes [Bousmah2024]. En particulier, la liaison de l’αRep réduit le pKa de la Citrine de 0,75 unités de pH, diminuant ainsi sa sensibilité aux fluctuations de pH. Cet effet peut être généralisé à d'autres YFPs telles que la Venus et l’EYFP in vitro.