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Dans le cadre d’un projet débuté en 2013 avec l’Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale (INSERM) et des centres de neuropédiatrie de l’Assistance Publique –Hôpitaux de Paris (APHP), nous explorons le lipidome de l’érythrocyte sanguin ou globule rouge (GR).
Les globules rouges (GR) présentent un intérêt clinique considérable en raison de leurs propriétés morphologiques particulières qui leur confèrent des fonctions biologiques essentielles (transport de l'O2 et du CO2 via l'hémoglobine, régulation du pH sanguin, fonctions enzymatiques...). Des études récentes ont montré que certaines pathologies érythrocytaires sont liées à une composition lipidique anormale. C'est le cas par exemple de la maladie de Gaucher (MG) [1-4]. L'analyse lipidomique occupe donc une place centrale dans le diagnostic précoce et le suivi thérapeutique de ce type de pathologies, mais également dans la compréhension des voies métaboliques mises en jeu. Dans notre laboratoire, nous avons développé et validé une méthode de chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse ((LC-MS/MS). Celle-ci nous a permis d’identifier et de doser 4 biomarqueurs lipidiques de la MG et de corréler leurs concentrations aux anomalies morphologiques et rhéologiques du GR [3-5]. Nous avons pu également, en utilisant une méthode semi-ciblée, identifier avec certitude plus de 260 espèces  moléculaires de sphingolipides (SL) et de phospholipides (PL) érythrocytaires, ouvrant ainsi la voie à une exploration approfondie du lipidome érythrocytaire [5]. Parallèlement, afin d’obtenir une information directe sur la morphologie du GR et la distribution spatiale des lipides à l’échelle cellulaire, nous avons adopté une  méthodologie utilisant la microscopie de force atomique couplée à la spectroscopie infra-rouge (AFM-IR). Cette technique émergente permet de combiner la résolution spatiale de l’AFM et l’information structurale de l’IR [6]. Nos premiers résultats nous ont permis de mettre en évidence l’intérêt de cette technique et  d’observer des différences (topographiques et spectrales) entre des GR sains et des GR de la MG. Les deux techniques (SM et AFM-IR) apparaissent donc comme  des outils essentiels et complémentaires pour comprendre l’origine des altérations morphologiques du GR due à une composition lipidique anormale. La thèse  proposée s’inscrit dans ce projet et concerne la recherche de biomarqueurs lipidiques de pathologies liées au GR. Deux axes de recherche seront explorés : (1) le  profilage lipidique semiciblé du GR, et (2) l’identification de marqueurs de l’oxydation lipidique. (1) Le profilage lipidique consistera à poursuivre l’exploration du  lipidome afin de pouvoir comparer le profil lipidique du GR sain avec celui d’un GR pathologique. Cette comparaison est importante pour la connaissance des voies  métaboliques impliquées dans une maladie et pourra à terme être une aide précieuse pour le diagnostic précoce, la mise en oeuvre d’un traitement spécifique et le  suivi thérapeutique. (2) Certains lipides oxydés peuvent être considérés comme des marqueurs de risque et/ou de progression de certains troubles dans lesquels est impliqué du stress oxydant [7-9]. Ainsi, un travail sur la lipidomique oxydative sera initié. Le cas des lipides oxydés constitue un challenge analytique en raison de leur très grande diversité structurale (composition élémentaire et possibilité d’isomères), de leur faible concentration dans les échantillons biologiques et du manque de standards [8-9]. Pour contourner cette difficulté, nous souhaitons entamer une étude de l’oxydation de lipides spécifiques sous conditions contrôlées. Pour atteindre nos objectifs, nous utiliserons des technologies et des outils permettant d’identifier et de quantifier les substances présentes dans les milieux  complexes, tels que le couplage UHPLCMS(/ MS), la spectrométrie de masse haute résolution (HRMS), la mobilité ionique (IMS), l’AFM-IR et la RMN. Les lipides  oxydés seront générés sous radiolyse.

In the context of a project started in 2013 with the Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale (INSERM) and the neuropediatric centers of Assistance Publique – Hôpitaux de Paris (APHP), we are exploring the lipidome of the blood erythrocyte or red blood cell (RBC). Red blood cells (RBCs) are of considerable clinical interest due to their particular morphological properties which give them essential biological functions (transport of O2 and CO2 via hemoglobin, regulation of blood pH, enzymatic functions, etc). Recent studies have shown that certain erythrocyte pathologies are linked to abnormal lipid composition. This is the case, for example, of Gaucher disease (GD) [1-4]. Lipidomic analysis therefore occupies an important place in the early diagnosis and therapeutic monitoring of this type of pathologies, but also in the understanding of the metabolic pathways involved. In our laboratory, we developed and validated a method using liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC-MS/MS). This allowed us to identify and quantify 4 lipid biomarkers of GD and to correlate their concentrations to the morphological and rheological abnormalities of the RBC [3-5]. We were also able, using a semi-targeted method, to identify more than 260 molecular species of erythrocyte sphingolipids (SL) and phospholipids (PL), allowing in-depth exploration of the erythrocyte lipidome [5]. At the same time, in order to obtain direct information on the morphology of the RBC and the spatial distribution of lipids at the cellular scale, we adopted a methodology using atomic force microscopy coupled to infrared spectroscopy (AFM-IR). This emerging technique allows us to combine the spatial resolution of AFM and the structural information of IR [6]. Our first results allowed us to highlight the interest of this technique and to observe topographic and spectral differences between healthy RBCs and GD RBCs. Both techniques (MS and AFM-IR) therefore appear to be essential and complementary tools for understanding the origin of morphological alterations of the RBC due to an abnormal lipid composition. The proposed thesis is part of this project and concerns the search for lipid biomarkers of pathologies
linked to RBC. Two lines of research will be explored: (1) semi-targeted lipid profiling of the RBC, and (2) the identification of markers of lipid oxidation. (1) Lipid profiling will consist of continuing the exploration of the lipidome in order to be able to compare the lipid profile of healthy RBC with that of pathological RBC. This comparison is important for understanding the metabolic pathways involved in a disease and could ultimately be a valuable aid for early diagnosis, the implementation of a specific treatment and therapeutic monitoring. (2) Certain oxidized lipids can be considered as markers of risk and/or progression of certain disorders in which oxidative stress is involved [7-9]. Thus, work on oxidative lipidomics will be initiated. The case of oxidized lipids constitutes an analytical challenge due to their very great structural diversity (elemental composition and possibility of isomers), their low concentration in biological samples and
the lack of standards [8-9]. To get around this difficulty, we wish to begin a study of the oxidation of specific lipids under controlled conditions. To achieve our objectives, we will use technologies and tools to identify and quantify substances present in complex samples, such as UHPLC-MS(/MS), high resolution mass spectrometry (HRMS), ion mobility (IMS), AFM-IR and NMR. The oxidized lipids will be generated under radiolysis.

Références / References :
1- M. Franco, E. Collec, P. Connes, E. van den Akker, T. Billette de Villemeur, N. Belmatoug, M. von
Lindern, N. Ameziane, O. Hermine, Y. Colin, C. Le Van Kim, C. Mignot, Abnormal properties of red
blood cells suggest a role in the pathophysiology of Gaucher disease ; Blood (2013) 121, 546-556.
2-P.K. Mistry, J. Liu, L. Sun, WL Chuang, T. Yuen, R. Yang, P. Lu, K. Zhang, J. Li, J. Keutzer, A.
Stachnik, A. Mennone, J.L. Boyer, D. Jain, R. O Brady, M. I New, M. Zaidi, Glucocerebrosidase 2 gene
deletion rescues type 1 Gaucher disease, PNAS (2014), 111, 4934-4939.
3- C. Chipeaux, M. de Person, N. Burguet, T. Billette de Villemeur, C. Rose, N. Belmatoug, S. Héron,
C. Le Van Kim, M. Franco, F. Moussa, Optimization of ultra-high pressure liquid chromatography –
tandem mass spectrometry determination in plasma and red blood cells of four sphingolipids and their
evaluation as biomarker candidates of Gaucher’s disease ; J. Chromatogr. A (2017) 1525, 116-125.
4- L. Dupuis, C. Chipeaux, E. Bourdelier, S. Martino, N. Reihani, N. Belmatoug, T. Billette de
Villemeur, B. Hivert, F. Moussa, C. Le Van Kim, M. de Person, M. Franco, Effects of sphingolipids
overload on red blood cell properties in Gaucher disease ; J. Cell. Mol. Med. (2020) 24, 9726-9736.
5- T. Bettioui, C. Chipeaux, K. Ben Arfa, S. Héron, N. Belmatoug, M. Franco, M. de Person, F. Moussa,
Development of a new online SPE-HPLC-MS/MS method for the profiling and quantification of
sphingolipids and phospholipids in red blood cells – Application to the study of the Gaucher’s disease;
Analytica Chimica Acta (2023) 1278, 341719.
6- A. Dazzi, C.B. Prater, AFM-IR: Technology and applications in nanoscale infrared spectroscopy and
chemical imaging ; Chemical Reviews (2017) 117 (7), 5146-5173.
7- D. Bonnefont-Rousselot, Les marqueurs de l’oxydation des lipides, Revue francophone des
laboratoires (2020), 522,47-55.
8- C.M. Spickett, R. Pitt, Oxidative lipidomics, coming of age: advances in analysis of oxidized
phospholipids in physiology and pathology, Antioxidants & Redox Signaling (2015) 22, 1646-1666.
9- K. Parchem, S. Sasson, C. Ferreri, A. Bartoszeck, Qualitative analysis of phospholipids and their
oxidized derivatives – used techniques and examples of their applications related to lipidomic