English version below

La NADPH oxydase est une enzyme qui est indispensable au système immunitaire innée. Elle génère les espèces réactives de l’oxygène (ROS) nécessaire pour détruire les microbes séquestrés dans les phagosomes des globules blancs (neutrophiles). Une déficience de son activité est à l’origine d’une maladie génétique immunitaire rare dans laquelle les patients (souvent très jeunes) subissent des infections très sévères, voire mortelles. D’un autre côté, une activité excessive de la NADPH oxydase contribue à des situations inflammatoires qui endommagent les tissus (polyarthrite rhumatoïde) ou contribuent à des maladies pulmonaires obstructives chroniques. Pour éviter ces situations pathologiques, la NADPH oxydase est parfaitement régulée dans le temps et dans l’espace cellulaire en passant d'un état inactif ('au repos') à un état actif de manière précise et coordonnée selon les besoins de la cellule.

Le projet de thèse vise à comprendre comment l’état actif de la NADPH oxydase s’adapte aux besoins de la cellule. Le complexe NADPH oxydase illustre parfaitement la complexité de ces enzymes oligomériques dont l’assemblage et le fonctionnement dépendent de différents paramètres et partenaires. L’objectif est de décrypter l’assemblage supramoléculaire de l’enzyme active en fonction des diverses conditions physiologiques rencontrées, et en les corrélant aux activités spécifiques de l'enzyme. Les changements de conformation de l'enzyme, ainsi que les interactions spécifiques entre les protéines et la membrane biologique, qui sont essentiels à l'activation de la NADPH oxydase, seront étudiés et clarifiés. Ces connaissances sont indispensables pour pouvoir proposer des modulateurs pharmacologiques efficaces et ciblés. Pour explorer la relation structure-fonction de la NADPH oxydase, nous disposons d’un large panel d’outils biologiques parmi lesquelles des protéines chimériques et des systèmes membranaires qui permettent de reconstituer le système fonctionnel à une échelle nanométrique. Ces nanosystèmes offrent l’avantage de simplifier l’étude de la NADPH oxydase en s’affranchissant de la complexité cellulaire, tout en permettant de recréer un large éventail de configurations d’assemblage, reproduisant fidèlement les interactions protéines-protéines et protéines-lipides qui pourraient avoir lieu in vivo. Leur analyse fonctionnelle s’appuiera sur des techniques de spectrophotométrie (absorption/fluorescence stationnaire et résolue en temps), enrichies par des études approfondies en biologie, biochimie et en biophysique (microscopie confocale, chromatographies, Résonance Plasmonique de Surface (SPR), Interférométrie de biocouches (BLI)) pour suivre la dynamique des assemblages. Leurs caractéristiques physiques seront analysées par des techniques analytiques de pointe telles que la photométrie de masse (PM) et par des techniques d’analyse structurale (synchrotron SOLEIL, ou autres comme la diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) et le dichroisme circulaire (CD). Les architectures obtenues seront combinées à des données AlphaFold de prédiction de structures. Cela fournira des informations cruciales sur les mécanismes moléculaires qui régissent le fonctionnement du complexe enzymatique. Ces données permettront d'aborder des questions physiologiques clés concernant sa régulation.

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NADPH oxidase is an enzyme that is essential to the innate immune system. It generates the reactive oxygen species (ROS) needed to destroy microbes sequestered in the phagosomes of white blood cells (neutrophils). A deficiency in its activity is the cause of a rare genetic immune disease in which patients (often very young) suffer very severe, even fatal, infections. On the other hand, excessive NADPH oxidase activity contributes to inflammatory situations that damage tissues (rheumatoid arthritis) or contribute to chronic obstructive pulmonary disease. To avoid these pathological situations, NADPH oxidase is perfectly regulated in cellular time and space, switching from an inactive state (“resting state”) to an active state in a precise and coordinated manner according to the needs of the cell.
This thesis project aims to understand how the active state of NADPH oxidase adapts to the needs of the cell. The NADPH oxidase complex perfectly illustrates the complexity of these oligomeric enzymes, whose assembly and function depend on different parameters and partners. The aim is to decipher the supramolecular assembly of the active enzyme as a function of the various physiological conditions encountered and correlate them with the specific activities of the enzyme. The conformational changes of the enzyme and the specific interactions between proteins and the biological membrane, which are essential for the activation of NADPH oxidase, will be studied and clarified. This knowledge is essential for proposing effective, targeted pharmacological modulators. To explore the structure-function relationship of NADPH oxidase, we have a wide range of biological tools at our disposal, including chimeric proteins and membrane systems that enable us to reconstitute the functional system on a nanometric scale. These nanosystems offer the advantage of simplifying the study of NADPH oxidase by freeing it from cellular complexity while enabling us to recreate a wide range of assembly configurations, faithfully reproducing the protein-protein and protein-lipid interactions that may occur in vivo. Their functional analysis will be based on spectrophotometric techniques (stationary and time-resolved absorption/fluorescence), enhanced by in-depth studies in biology, biochemistry, and biophysics (confocal microscopy, chromatography, Surface Plasmon Resonance (SPR), Biolayer Interferometry (BLI)) to follow the dynamics of the assemblies. Their physical characteristics will be analyzed using state-of-the-art analytical techniques such as mass photometry (MP) and structural analysis techniques (at SOLEIL synchrotron, or others) such as small-angle X-ray scattering (SAXS) and circular dichroism (CD). The resulting architectures will be combined with AlphaFold structure prediction data. This will provide crucial information on the molecular mechanisms that govern the functioning of the enzyme complex. These data will make possible to address key physiological questions concerning its regulation.

References:
-Aimeur, A. et coll. Structural profiles of the full phagocyte NADPH oxidase unveiled by combining computational biology and experimental knowledge. Journal of Biological Chemistry, 300, 12 (2024) doi 10.1016/j.jbc.2024.107943
-Al Abyad, D., et coll. Role of the phospholipid binding sites, PX of p47phox and PB region of Rac1, in the formation of the phagocyte NADPH oxidase complex NOX2 Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -Biomembranes 1865:184180 (2023) doi 10.1016/ j.bbamem.2023.184180
-Cipriano, A. et coll. NADPH Oxidases: From Molecular Mechanisms to Current Inhibitors J Med Chem 66(17):11632(2023) DOI: 10.1021/ acs.jmedchem.3c00770
-Stasia, M.J., Roos, D. (2023). Chronic Granulomatous Disease. In: Pick, E. (eds) NADPH Oxidases Revisited: From Function to Structure. Springer, Cham. https://doi.org/10.1007/978-3-031-23752-2_32
- Vermot, A., et coll. (2021) NADPH Oxidases (NOX): An Overview from Discovery, Molecular Mechanisms to Physiology and Pathology, Antioxidants (Basel) 10, 10.3390/antiox10060890