English version below

L’imagerie de fluorescence est indispensable pour comprendre le fonctionnement du vivant, tant en situation physiologique que pathologique. Les protéines fluorescentes sont des sondes fluorescentes codées génétiquement très couramment utilisées pour observer les composants cellulaires, leur dynamique et leurs interactions. Les chercheurs disposent de protéines fluorescentes de toutes les couleurs, du bleu au rouge, et très brillantes, capables d’absorber et de fluorescer efficacement. Toutefois, comme tous les fluorophores, les protéines fluorescentes perdent progressivement leur fluorescence sous illumination en raison de réactions multiples et complexes à l’état excité : c’est le photoblanchiment. Nous étudions les mécanismes du photoblanchiment à l’échelle moléculaire afin de proposer des protéines fluorescentes plus robustes, capables d'être imagées plus longtemps ou sous des puissances d’illumination plus élevées, et ainsi améliorer la résolution spatiale et temporelle des images acquises. Cela permettra d'explorer plus finement les phénomènes biologiques à l’échelle nanométrique et/ou sur des durées de plusieurs heures. Il faudra pour ce projet combiner des méthodes de spectroscopie et de microscopie de fluorescence avec de la spectrométrie de masse. Un volet théorique, avec des approches de dynamique moléculaire, pourra être envisagée en fonction du profil du candidat . Une stratégie de mutagenèse et de screening de nouveaux variants sera ensuite envisagée.

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Fluorescence imaging is essential for understanding the functioning of living organisms, both in physiological and pathological conditions. Fluorescent proteins are genetically encoded fluorescent probes widely used to observe cellular components, their dynamics, and their interactions. Researchers have access to fluorescent proteins in all colors, from blue to red, which are bright and able to absorb and fluoresce efficiently. However, like all fluorophores, fluorescent proteins gradually lose their fluorescence under illumination due to multiple and complex reactions in the excited state: this is photobleaching. We study photobleaching mechanisms at the molecular level to design more robust fluorescent proteins that can be imaged for extended periods or under higher illumination power, thereby improving the spatial and temporal resolution of acquired images. This will improve the observation of biological phenomena at the nanometer scale and/or over a long exposure time. For this project, it will necessary to combine spectroscopy and microscopy methods with mass spectrometry. A theoretical approach using molecular dynamics will also be considered, depending on the background of the PhD student. Then, strategies of mutagenesis and screening will be implemented to develop new variants.

Références:

- Photoinduced Chemistry in Fluorescent Proteins: Curse or Blessing?, Acharya et al, Chem Rev 2017, 117, 758−795
- Breaking up the StayGold dimer yields three photostable monomers, Goedhart and Gadella, Nat Methods 2024 21(4):558-559.
- Structural Evidence for a Two-Regime Photobleaching Mechanism in a Reversibly Switchable Fluorescent Protein, Duan, Adam, Byrdin, Ridard, Kieffer-Jaquinod, Morlot, Arcize, Demachy, Bourgeois JACS 135(42) 15841–15850
- tdLanYFP, a Yellow, Bright, Photostable, and pH-Insensitive Fluorescent Protein for Live-Cell Imaging and Förster Resonance Energy
- Transfer-Based Sensing Strategies, Bousmah, Valenta, Bertolin, Singh, Nicolas, Pasquier,Tramier, Merola, Erard, ACS Sens, 26;6(11):3940-3947
- General information on fluorescent proteins : https://www.fpbase.org/