Relation structure-fonction, membranes et assemblage du complexe
Laura Baciou (DR), Chantal Houée (PREM), Tania Bizouarn (CR-HDR), Marie Erard (PR), Oliver Nüsse (PR), Xavier Serfaty (Post Doc)
Alumni : Sophie Dupré-Crochet (PR à l’UVSQ depuis 2024), Aicha Bouraoui (Doc 16-19), Dina Al Abyad (Doc 19-22) Sana Aimeur (Doc 20-23), Elodie Hudik (AI)
Notre objectif est de comprendre comment la stabilité et l’activité du complexe NADPH oxydase sont influencés par la dynamique de son assemblage et des interactions lipide-protéine. Ces phénomènes pilotent la transition de l’état inactif à l’état actif de la NADPH oxydase, mais évoluent dans le temps ou selon les conditions physiologiques. Puisque toute dérégulation de son activité conduit ou participe à des pathologies graves (immunitaire ou neurodégénératives), explorer à un niveau moléculaire ces mécanismes reste essentiel pour identifier des stratégies efficaces pour contrôler son fonctionnement. Pour appréhender la complexité de ces processus d’assemblage et d’activation de la NADPH oxydase, nous menons des travaux en développant plusieurs approches complémentaires de biologie, biochimie et de biophysique.
Etudes fonctionnelles
En utilisant des techniques de biologie moléculaire et de biochimie, les différentes composantes du complexe NADPH oxydase sont produites en bactéries, en levures, ou bien issues de cellules phagocytaires isolés à partir de donneurs (Etablissement du Sang Français). Ces composantes sont utilisées pour reconstituer des systèmes fonctionnels in vitro avec des compositions et des environnements contrôlés, en s’affranchissant des contraintes ou des biais d’études en cellules. Des degrés de complexité variés du complexe NADPH oxydase sont étudiés: allant des systèmes isolés (en détergent ou en polymères) à des vésicules de membranes artificielles (liposomes petits (SUV) ou géants (GUV)), ou de membranes biologiques (neutrophiles, lignées cellulaires). Nous optimisons continuellement nos objets d’études afin de nous affranchir de biais expérimentaux de détection et de mesure [Serfaty2020].
En utilisant des techniques d’oxymétrie et de spectroscopies (absorption/fluorescence stationnaire et résolue en temps, stopped-flow, bilayer interférométrie, ITC, (Far) Western Blot, microscopie confocale), nous caractérisons les propriétés enzymatiques (Km, KI, vitesses des réactions) et d’assemblage du complexe NADPH oxydase.
Les protéines de la NADPH oxydase sont purifiées et assemblées in vitro en vésicules membranaires. Leur activité est suivie par plusieurs méthodes spectroscopiques complémentaires [Thèse Xavier Serfaty 2019]
Cela nous permet d’explorer le rôle de l’environnement membranaire sur l’assemblage et l’activité de l’enzyme (cholestérol, phosphoinositides, …) [Baciou2018 , AlAbyad2023], mais également d’identifier de nouvelles composantes protéiques susceptibles de réguler son activité [Bouraoui2023].
Images de microscopie à fluorescence confocale à disque tournant montrant la liaison du trimère GFP prototype aux membranes de géantes liposomes en présence d'acide arachidonique (AA). [AlAbyad2023]
Effet de la composition membranaire sur l'activité de la NADPH oxydase [Baciou2018]
Etudes structurales
Pour décrypter les conformations et leur changement au cours de l’activation du complexe enzymatique, nous combinons aux études fonctionnelles du complexe, des études structurales par des techniques de dichroïsme circulaire et de Small-angle X-ray Scattering (SAXS) sur Synchrotron et des approches utilisant des stratégies d’intelligence artificielle (Alphafold) [Aimeur2024, Versini2023].
Modèle Alphafold du Complexe NADPH oxydase fonctionnel [Aimeur2024]
Le système au repos a été étudié en cellules. Dans celui-ci, les protéines cytosoliques p47phox, p67phox, p40phox sont retenues dans le cytosol sous la forme d’un hétérotrimère pour empêcher leur interaction avec les composantes membranaires. Par microscopie FRET-FLIM couplée à des données de SAXS, nous avons montré leur mode d’assemblage en cellules et proposé le premier modèle 3D de cet hétérotrimère [Ziegler2019].